Inhalt der Folge:

• In der heutigen Podcastfolge besprechen wir die Gramfärbung im Detail.
• Wir gehen zuerst die Theorie hinter der Gramfärbung durch und besprechen inwiefern sich grampositive und gramnegative Bakterien unterscheiden.
• Abschließend zeige ich euch noch den genauen praktischen Arbeitsvorgang.

Die Differenzialfärbung: Gramfärbung

Definition Differenzialfärbung:

Bestehend aus Färbung und Gegenfärbung, dienen sie der Differenzierung und Identifizierung von Bakterien aufgrund der Unterschiede im Färbeverhalten.

Die Unterschiede zwischen grampositiv und gramnegativ

• Die Gramfärbung ermöglicht die Aufteilung der Bakterien in zwei große Gruppen:
  1. Grampositive Bakterien
  2. Gramnegative Bakterien
• Sie unterscheiden sich grundlegend im Aufbau ihrer Zellwand und in anderen Eigenschaften wie z.B.: der Empfindlichkeit gegen Antibiotika.
• Der Hauptunterschied liegt in der deutlich dickeren Mureinschicht der grampositiven Bakterien!

Die Theorie hinter der Gramfärbung

Schritt 1: Kristallviolett

• Die hitzefixierten Bakterien werden mit dem kationischen Farbstoff Kristallviolett angefärbt.
• Das Kristallviolett dringt in die Zellen ein und reagiert zum Teil mit den sauren Gruppen des Protoplasmas.

Nach diesem Schritt sind alle Bakterienzellen blau.

Schritt 2: Lugolsche Lösung

• Die Bakterien werden mit einer Iod-Kaliumiodid-Lösung (Lugolsche Lösung) gebeizt.
• Es kommt zur Bildung eines tiefblau-violetten Farbstoff-Iod-Komplexes.
• Das kleinere Chlorid-Anion des Kristallvioletts wird gegen das größere Iodid-Anion ausgetauscht.
• Der Farbstoff-Iod-Komplex wird dadurch wasserunlöslich und fällt als Feststoff aus.

Nach diesem Schritt bleiben weiterhin alle Bakterienzellen blau.

Schritt 3: Ethanol

• Die Zellen werden mittels Ethanol (organisches Lösemittel) differenziert.
• Das Ethanol löst den Farbstoff-Iod-Komplex wieder.

Was passiert mit den grampositiven Bakterien?

• Die Alkoholbehandlung dehydratisiert die Mureinschicht, lässt sie schrumpfen und engmaschiger werden.
• Der Farbstoff-Iod-Komplex wird bei den grampositiven Bakterien von dem dicken, vielschichtigen, engmaschigen Peptidoglykannetz (Mureinschicht) der Zellwand im Zellinneren zurückgehalten!

Nach diesem Schritt bleiben weiterhin alle grampositiven Bakterienzellen blau.

Was passiert mit den gramnegativen Bakterien?

• Durch die Ethanolbehandlung wird die äußere Membran von der Zelloberfläche abgelöst.
• In der darunter liegenden, eher dünnen und relativ wenig vernetzten Mureinschicht treten Löcher auf.
• Der Farbstoff-Iod-Komplex kann die Zellen nun leicht verlassen.
• Die gramnegativen Bakterienzellen werden entfärbt.

Nach diesem Schritt sind alle gramnegativen Bakterienzellen entfärbt bzw. farblos.

Schritt 4: Safranin

• Die Gegenfärbung mit Safranin führt dazu, dass sich ausschließlich die zuvor entfärbten, gramnegativen Bakterienzellen rot färben!
• Dies dient der besseren Abhebung unter dem Mikroskop.

Nach diesem Schritt bleiben weiterhin alle grampositiven Bakterienzellen blau.

Alle gramnegativen Bakterienzellen sind nun rot angefärbt.

Die Praxis hinter der Gramfärbung – Der genaue Arbeitsablauf

1. Die zu untersuchenden Bakterien durch Hitzefixierung auf einen Objektträger fixieren.
2. Die fixierten Bakterien ganz mit Kristallviolett-Lösung bedecken.
   • 1 Minute einwirken lassen.
3. Kristallviolett-Lösung abgießen.
4. Objektträger schräg halten und mit Auftropfen von Lugolscher Lösung auswaschen (nicht mit Wasser auswaschen, da der Farbstoff erst nach dem Schritt mit der Lugolschen Lösung wasserunlöslich wird!)
5. Objektträger ganz mit Lugolscher Lösung bedecken.
   • 1 Minute einwirken lassen.
6. Den Objektträger schräg gegen ein weißes Papier halten.
7. Vom oberen Rand tropfenweise 96%-igen Ethanol gleichmäßig verteilt über den Objektträger laufen lassen, bis der abtropfende Ethanol farblos ist.
   • Höchstens 10 Sekunden mit Ethanol differenzieren, sonst löst sich der Farbstoff-Iod-Komplex auch bei den grampositiven Bakterien.
8. Sofort 5 Sekunden mit Wasser spülen!
9. Objektträger mit Safranin bedecken.
   • 1 Minute einwirken lassen.
10. Safranin abgießen.
11. Objektträger vorsichtig unter Leitungswasser spülen, bis keine Farbe mehr abläuft.
12. Präparat unter einem Mikroskop auswerten.

Grampositive Bakterien können sich gramnegativ verhalten, wenn…

• …zu stark mit Ethanol entfärbt wurde.
• …die Zellwände durch fehlerhafte Hitzefixierung beschädigt sind.

Hier kommst du zurück zur Folgenübersicht!